脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）精子和胚胎体外保存的研究

【摘要】近年来,低温生物学的发展越来越迅速。脊尾白虾作为重要的经济虾之一,在精子和胚胎方面的研究还较少。本论文对脊尾白虾的精子和胚胎体外保存做了相关的研究,为其精子和胚胎的超低温(-196℃)保存筛选了适宜的条件。这些研究为提高脊尾白虾精子超低温冷冻效果提供理论指导,以及为其精子代谢及生理研究提供参考。胚胎的体外保存可以随时为育苗和生产的研究提供材料。以上研究对脊尾白虾种质优选、雌核发育、建立优良种质都具有重要意义。在脊尾白虾精子体外保存的研究中,采用染色法和顶体酶活力两种方法,研究了环境因子对精子活力的影响,当盐度在20-25‰,pH在8.0时,精子的存活率和顶体酶活力较高。在稀释剂和抗冻剂筛选的研究中,稀释剂I-壬氏液为脊尾白虾精子体外保存的最佳稀释剂,4℃下保存4d后,稀释剂I组精子存活率为71.50%,顶体酶活力为1.80μIU/106,两种指标值均高于其他实验组,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性显著y=0.846(p<0.05)；在液氮(-196℃)下保存2d后,稀释剂I组精子存活率达83.50%,顶体酶活力为2.51μIU/106,两种指标值均高于其他各组以及4℃下稀释剂I组同期保存效果,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,γ=0.862(p<0.01)。15%DMSO为脊尾白虾精子超低温保存的最佳抗冻剂,此条件下超低温保存2d后,精子存活率为81.32%,顶体酶活力为1.39gIU/106,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,相关系数y=0.864(p<0.01)。本文还研究了超低温冷冻保存对脊尾白虾精子内琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、Na+/K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)与顶体酶(ACE)活性的影响,以期为提高脊尾白虾精子超低温冷冻效果提供理论依据。设置对照组、3个实验组,于冷冻0、1、3、5、7、15d取样测定各酶活性。结果表明,冷冻后,除GR外,其他所测酶活性均出现显著下降p<0.05),且以对照组酶活性下降幅度最大。GR活性在冷冻7d内显著升高,且对照组明显高于实验组(p<0.05),在冷冻15d时又出现下降。添加15%DMSO组所测酶活性均高于同期其它各组,表明15%DMSO对精子内酶的保护作用较好。从冷冻后各酶下降幅度来看,超低温冷冻对SOD活性的影响最大,其次是Na+/K+-ATP酶。通过单细胞凝胶电泳技术(SCGE)对超低温对精子细胞DNA损伤进行了研究,冷冻后精子DNA受到了不同程度的损伤。鲜精的彗星细胞比例为6.67%,冷冻后,对照组细胞DNA损伤率显著高于实验组(p<0.050.00%。此结果表明在超低温冷冻保存中添加抗冻剂是必要的。15%DMSO抗冻剂下细胞DNA损伤最低,低于其它浓度抗冻剂。该研究为深入研究脊尾白虾精子冷冻损伤提供了科学依据。脊尾白虾胚胎体外保存的研究中,研究得出盐度在20-25‰,pH在7.0时,胚胎的存活率最高。筛选的7种稀释剂中,使用BS2溶液时,胚胎的保存效果较好。选取了DMSO、GLY、1,2-PG作为抗冻剂,发现对胚胎的毒性由大到小依次是1,2-PG、DMSO、GLY,且浓度5%-10%,存活率升高,10%-20%时,保存效果下降。10%GLY为脊尾白虾超低温保存的最佳抗冻剂,在冷冻10d后的存活率为78.94%。在研究超低温冷冻对脊尾白虾胚胎脂肪酸影响时,发现超低温冷冻保存后各组分发生了明显变化。脊尾白虾胚胎中主要含有29种脂肪酸,碳链长度主要是在C14到C24之间,其中饱和脂肪酸(SFAs)有9种,占37.948%,单不饱和脂肪酸(MUFAs)有8种,占30.091%,多不饱和脂肪酸(PUFAs)有9种,占30.763%。冷冻后,饱和脂肪酸中C15：0和C17：0含量明显下降,对照组与实验组差异显著(p<0.05)。C16：0和C18：0的含量显著上升,对照组与实验组差异显著。单不饱和脂肪酸C16：1超低温冷冻后对照组显著上升,其余实验组显著下降,且与新鲜胚胎、对照组差异性显著(p<0.05)。胚胎冷冻后C18：1n9c(顺)显著上升,各组间差异性显著(p<0.05)。多不饱和脂肪酸C18:2n6c在冷冻后,各组间存在显著差异(p<0.05)。DHA含量在冷冻后显著下降,各组间含量存在显著性差异(p<0.05),EPA在冷冻后含量显著下降。Cn-3/Cn-6呈下降趋势。分析结果发现,添加抗冻剂与未添加抗冻剂各组差异显著。
【作者】浦蕴惠；
【导师】阎斌伦；刘兆普；
【作者基本信息】南京农业大学，海洋生物学，2013，硕士
【关键词】脊尾白虾；精子；胚胎；体外保存；

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